Хабрахабр

Задачи отечественного секвенаторостроения (июнь, 2019 г.)

Перед чтением этого апгрейда желательно ознакомиться с опубликованным ранее исходником.

руб.), разработанный компанией Oxford Nanopore Technologies (ONT), работает на одноразовых ячейках, каждая из которых стоит $900 (в России – 135 тыс. Самый первый и самый популярный на сегодняшний день нанопоровый секвенатор MinION (минимальный комплект в UK — $1000, в России – 150 тыс. Такие ячейки позволяют за 2…3 дня оцифровать ДНК длиной 10…20 Gb. руб.). Этого слишком мало для секвенирования генома человека (нужно >100 Gb), но слишком много для всех прочих клинико-диагностических целей (достаточно <1 Gb).

Дороже стоят и их более производительные расходные ячейки ($2 000/шт., >100 Gb). Недавно стартовали продажи более производительных (и более дорогих) моделей – PromethION 24/48 ($165 000/$285 000), нацеленных преимущественно на поточное полногеномное секвенирование. руб. Правда, оптом они могут стоить дешевле ($1 800 000 за 720 шт., $625/шт.), но для российского бюджета подобные приобретения (200…250 млн. за партию) непозволительны.

Поэтому наибольшее внимание посетителей недавней (22-24 мая) конференции компании ONT привлекло сообщение о начале продаж Flongle — адапторной вставки к секвенатору MinION, позволяющей работать с менее производительными (~1 Gb), но сравнительно дешёвыми ($90) одноразовыми ячейками. Да и не только для российского.

https://nanoporetech.com/products

Но для большинства российских пациентов NGS-диагностика по-прежнему останется непозволительной роскошью, поскольку стоимость ячеек к Flongle на отечественном рынке будет выше 10 тысяч рублей. Появление Flongle способно вызвать взрывной рост применения NGS (next generation sequencing) в клинической практике и потеснить обычную ПЦР-диагностику, объём рынка которой в России превышает миллиард рублей, а в мире измеряется миллиардами долларов. А если к ней добавить стоимость расходных реагентов, транспортные издержки и накладные расходы, то расчётная цена секвенирования одной пробы ДНК/РНК не опустится ниже 20 тысяч рублей.
Отсюда следует необходимость разработки отечественных нанопоровых секвенаторов и их обеспечения дешёвыми расходными материалами и реагентами.

Наноридер

Значительно удешевить нанопоровое секвенирование можно при помощи многократного использования ячеек для Flongle и импортозамещения необходимых для работы с ними расходных реагентов. Но для начала нужно обзавестись тестовым устройством, позволяющим наблюдать за формированием бислойных липидных мембран (БЛМ) на 126 лунках рабочей ячейки, и оценивать количество и качество встраиваемых в эти мембраны нанопор. Такое устройство («Наноридер»?) должно отслеживать изменения электропроводности (и/или импеданса) отдельных лунок при формировании на них БЛМ, и регистрировать протекающие через одиночные ионные каналы пикоамперные токи.

0 ридер можно из стандартных элементов: FPGA (100…200$), усилители тока (MAX9923FEUB – 200…300 руб.), АЦП (1…2 тыс. Скомпоновать подключаемый к компьютеру по USB 2. Или с её упрощённым отечественным аналогом, содержащим меньшее количество (16…32) сенсорных лунок. руб.) и т.п… Разработать придётся только плату с нестандартной контактной площадкой (10x13) типа LGA (Land Grid Array) для стыковки с ячейкой от Flongle.

Сенсорная площадка ячейки Flongle

И обойтись без применения специальных 512-канальных чипов, в разработку которых оксфордцы вложили десятки миллионов долларов. Снижение расчётной производительности ячеек в 4…8 раз (до 10…20 Mb) не критично для решения многих задач (определения патогенов, HLA-типирования, установления отцовства, идентификации личности и т.д.), зато позволяет собрать нанопоровый секвенатор на обычных усилителях пикоамперных токов. руб.). Правда, каждый многоканальный наноридер должен содержать больше десятка усилителей тока + АЦП, но всё равно он может стоить в несколько раз меньше фирменного сочетания MinION + Flongle (> 200 тыс. Что касается низкой производительности наноридера, то для российских пользователей, не имеющих приличных компьютеров (медиков, биологов, биохакеров и т.п.), она может оказаться даже полезной.

Килоридер

Разработанные оксфордцами 512-канальные усилители пикоамперных токов содержатся в каждой одноразовой ячейке к MinION. Отработанные ячейки можно выбрасывать, но лучше использовать содержащиеся в них чипы для производства аналогов Flongle, отличающихся повышенной производительностью. Если эти чипы оснастить поверхностными контактами, то они смогут работать с контактными ячейками, содержащими по 2048 (512х4) сенсорных лунок.
Разработать ячейки с такими LGA будет не просто, но нужно учитывать, что требования к контактам здесь менее строгие, чем у процессоров и материнских плат, у которых один плохой контакт способен вывести из строя всю систему. Для секвенатора неработоспособность даже половины контактов ячейки может считаться приемлемой. Оставшейся половины достаточно для обеспечения производительности на уровне 5…10 Gb.

Это позволит получить аналог секвенатора GridION X5, рассчитанный на одновременную работу с пятью (и более) многоразовыми ячейками отечественного производства. Логичным развитием этой идеи будет объединение в одном приборе нескольких подобных ридеров. Такой секвенатор может быть востребован во многих клинико-диагностических лабораториях.

https://store.nanoporetech.com/devices

А сами чипы являются 3000-канальными усилителями пикоамперных токов. Одноразовые ячейки секвенаторов PromethION содержат на чипах по 9000 сенсорных лунок. Поэтому секвенаторы данного типа обязательно комплектуются собственным суперкомпьютером. Поток выдаваемой ими с 24 (у PromethION 24) или с 48 (у PromethION 48) ячеек информации настолько велик, что в «сыром» виде его невозможно передать на обычный внешний компьютер. 0. Но если секвенатор будет работать только с одной ячейкой, то его можно будет подключать и к обычному игровому ноутбуку с портом Thunderbolt 3.

Но построенные на использовании таких чипов секвенаторы смогут работать только с программным обеспечением от ONT. Переделка бесплатных (выбрасываемых) чипов от ONT для работы с контактными ячейками не является неразрешимой проблемой. А разрабатывать подобные чипы с нуля слишком накладно. И усилия, которые придётся потратить на переделку этих программ, могут свести на нет преимущества от использования готовых чипов.

Мегаридер

В этом году должно начаться бета-тестирование нанопорового секвенатора компании AXBIO (США). В нём используются чипы с миллионом каналов усиления тока, производимые в Японии израильской компанией Tower Semiconductor Ltd… Расходными реагентами и продажей этих секвенаторов будет заниматься китайский филиал компании AXBIO.

По-видимому, это является основной причиной столь высокой интернационализации данной разработки. На территории США и Евросоюза нанопоровому секвенированию посвящены больше 7 тысяч патентов, что создаёт непредсказуемые финансовые риски для местных компании, пытающихся заниматься подобными технологиями. И передавать на компьютер только самые длинные и качественные риды. И позволяет российским компаниям и лабораториям без каких-либо ограничений участвовать в апробации и совершенствовании технологии AXBIO, а также производить (или собирать) такие секвенаторы на своей территории.
Терабайты сырых данных, получаемых нанопоровым секвенатором с мегапиксельными чипами (мегаридером), желательно фильтровать. Кроме того, избыточная производительность мегаридеров способна уменьшить продолжительность секвенирования генома человека с 2…3 суток (у ONT) до нескольких часов. Это позволит не только повысить качество секвенирования, но и понизить требования к компьютеру, что тоже немаловажно при массовом производстве и широком применении геномных секвенаторов.

Сумма технологий

Успеху компании ONT способствовала организация параллельной конвейерной оптимизации пяти основных элементов технологии нанопорового секвенирования – мембраны, нанопоры, “мотора” (хеликазы), условий секвенирования и алгоритмов расшифровки считываемых сигналов.

https://nanoporetech.com/resource-centre/videos/sub1000

Сейчас он составляет 6 недель, хотя обычно такие мембраны разрушаются за несколько дней. Гарантийный срок хранения ячеек для нанопорового секвенирования зависит в основном от стабильности бислойной липидной мембраны. Поэтому добиться стабильности БЛМ очень непросто.
Кардинально решить данную проблему позволяет формирование мембран в рабочих ячейках секвенатора и введение в них нанопор непосредственно перед использованием. Для увеличения срока их хранения используют гидрофобные полимерные добавки, поверхностно-активные блок-сополимеры, холестерин, антиоксиданты, поперечную сшивку жирных кислот и т.п., причём подобные модификации могут мешать формированию ионных каналов. Что касается сроков хранения, то для сухих ячеек он практически неограничен, а необходимые для их активации и регенерации реагенты могут храниться месяцами. Самостоятельная подготовка ячеек к работе обеспечит возможность их регенерации и многократного использования.

Поэтому одной из главных задач компании ONT был поиск мембранного белка, позволяющего получать результаты приемлемого качества. Самое узкое место в технологии нанопопрового секвенирования – это одновременно и самое узкое место нанопоры, от которого зависит качество считываемой информации.

Девять его субъединиц образуют в мембране ионный канал с широкими входным и выходным вестибюлями, и одним узким местом. Первым таким белком стал CsgG – белок наружной мембраны, встречающийся у многих грамотрицательных бактерий. 4. Но получить достаточно качественные нанопоры (R9, R9. 5. 1, R9. Этим летом в продаже должны появиться ячейки с порами следующего поколения (R10 или R10b), отличающимися повышенной точностью чтения гомополимерных повторов. 1) удалось только после перебора и анализа сотен модифицированных вариантов CsgG.


https://nanoporetech.com/about-us/news/london-calling-clive-brown-and-team-plenary

Максимальная скорость расплетания ДНК таким мотором сейчас достигает 450 пар нуклеотидов в секунду, хотя быстродействие электронных компонентов MinION позволяет повысить её до 1000 нуклеотидов в секунду. Обязательной составляющей технологии нанопорового секвенирования компании ONT является хеликаза – молекулярный мотор, расплетающий двунитевую ДНК и тормозящий продвижение однонитевой ДНК через нанопору. Поэтому более быстрые и процессивные хеликазы вряд ли улучшат производительность нанопоровых секвенаторов типа MinION и PromethION. Теоретически ускорение работы хеликазы способно удвоить производительность MinION, но на практике это может привести к ухудшению качества секвенирования.

Например, недавно было показано, что уменьшение концентрации расщепляемой хеликазой АТФ постепенно снижает точность результатов секвенирования, и теперь оксфордцы пытаются устранить эту проблему введением в реакционную смесь системы регенерации АТФ. Качество секвенирования зависит от множества условий — величины подаваемого на мембрану напряжения, электропроводности и ионного состава реакционной смеси, количества и характера закупоривающих поры примесей, возможности очистки закупоренных пор изменением полярности потенциала, структуры используемых адапторов и т.д, и т.п… Поэтому нанопоровое секвенирование требует тщательной оптимизации всех его параметров и составов рабочих растворов (Run Conditions), способных отрицательно повлиять на качество оцифровки нуклеотидных последовательностей.

В июле должен появиться очередной релиз программ Guppi и MinKNOW, в котором оксфордцы обещают добавить возможность определения метилированных оснований (5mC и 6mA). Пятым элементом технологии нанопорового секвенирования является искусственный интеллект, построенный на рекуррентных нейронных сетях (RNN) и на применении некоторых специальных алгоритмов и программ, улучшающих распознавание гомогенных повторов (Flip-flop, Medaka). Это немаловажно не только для эпигеномных исследований, но и для улучшения распознавания обычных оснований.

Поэтому далеко не каждый компьютер подходит для подключения MinION, в GridION и в PromethION ставятся графические ускорители последнего поколения, а одним из первых покупателей крупной партии модулей Jetson AGX Xavier (NVIDIA), предназначенных для устройств с искусственным интеллектом, стала компания Oxford Nanopore Technologies. Большие объёмы считываемой нанопоровыми секвенаторами информации и сложность её обработки предъявляют повышенные требования к аппаратной части таких программно-аппаратных комплексов.

Но постепенное повышение точности чтения ДНК, сочетающееся с большой длиной читаемых последовательностей, позволили ей если не опередить всех конкурентов, то по крайней мере определить главный вектор развития технологий геномного секвенирования. Ещё недавно нанопоровая технология считалась не более чем полезным дополнением к более точным технологиям флуоресцентного и полупроводникового секвенирования.

Основной проблемой является отсутствие в России целевого финансирования таких комплексных разработок. На освоение всех элементов технологии нанопорового секвенирования может понадобиться довольно много времени, но это не самая большая проблема. Но найти эту единственную строчку на 30 страницах текста не так-то просто. Правда, в недавно утвержденной Федеральной научно-технической программе развития генетических технологий на 2019–2027 годы (раздел «Направления реализации программы») сказано, что в краткосрочной перспективе (3…6 лет) будет разработан прототип прибора для высокопроизводительного геномного секвенирования. Проще договориться с китайцами о закупке секвенаторов AXBIO.

И потом ходить с протянутой рукой в поисках инвесторов, которые согласятся профинансировать разработку отечественной технологии нанопорового секвенирования. Ещё проще — найти умельцев, которые смогут «на коленке» собрать простейший наноридер.

Теги
Показать больше

Похожие статьи

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

Кнопка «Наверх»
Закрыть