Хабрахабр

SENS-Диагностика. Биомаркеры гликирования белков

Разработка терапии старения невозможна без достоверной диагностики старения. Не представляется разумным ожидание смерти человека или наступление смертельно опасного заболевания, чтобы понять: замедлили мы старение или нет, той или иной, терапией. Мы должны сразу видеть объективную картину, вызванными нашими интервенциями против старения.

То есть, нет возможности у пациента и лечащего врача детектировать возрастные изменения на молекулярном уровне, предшествующие наступлению заболеваний. В клинической практике пока не существует «большой диагностики старения». Мы хотим устранить этот пробел, прежде всего описав все основные маркеры возрастных изменения и доступный технологический уровень для их измерения.

Мы продолжим изложение концепции SENS-диагностики старения, исходя из того, что на сегодняшний день программа SENS (достижение пренебрежимого старения инженерными методами) наиболее полно описывает подходы по увеличению продолжительности жизни человека.

Но, следует отметить, что присоединение сахаров к другим молекулам – это далеко не всегда патология. Многие слышали о гликозилировании белков, конечных продуктах гликирования (КПГ, AGE) и о вреде, который они наносят организму. Так, значительная часть всех белков, синтезируемых в клетках, подвергаются ферментативному гликозилированию, что необходимо для их нормального функционирования. Само гликозилирование является очень распространённым и важным физиологичным процессом в живых организмах.

В связи со старением нас больше интересуют N-гликаны. В основном в гликозилировании участвуют два гликана (углеводной части связки углевод-органическая молекула): N-гликаны (связанные с амидной группой аспарагина) и О-гликаны (связанные с гидроксильной группой серина или треонина). И такое изменение играет одну из ключевых ролей в возрастном повышении общего воспаления в организме. Описано, что при старении меняется спектр сахарных цепочек, которые присоединяются к иммунным белкам при N-гликозилировании. Так, уровень гликозилированных антител IgG может предсказывать биологический возраст человека даже более точно, чем длина теломер [1].

В рамках программы европейского исследования биомаркеров старения MARK–AGE, завершившейся в 2013 году, был разработан тест GlycoAgeTest, определяющий биологический возраст человека. Кроме этого, ещё два гликана, NGA2F и N2AF, показали себя перспективными биомаркерами старения. Ещё одним потенциальным биомаркером старения и возраст-зависимых заболеваний (сердечно-сосудистых и диабета), описанным в рамках исследования MARK–AGE, стал гликопротеин кластерин, который участвует в стабилизации белковых структур [2]. В его основе – соотношение количества гликанов NGA2F (повышающихся с возрастом) и N2AF (уровень которых с возрастом понижается).

Кроме регулируемого организмом ферментативного гликозилирования существует неферментативная форма этого процесса, т.н. Перейдём теперь к рассмотрению патологической части этого явления. Следует отметить, что процесс неферментатиивного гликозилирования практически не регулируется. реакция Майяра, результатом которой становится появление в организме разнообразных продуктов гликирования. А также через инактивацию метилглиоксаля глиоксалазной системой: глиоксалаза I превращает метилглиоксаль и восстановленный глутатион в лактоилглутатион, который далее метаболизируется в D-лактат под действием глиоксалазы II.

Структура метилглиоксаля Хотя есть возможность «сдерживания» гликозилирования через трансгликацию, при которой в «расход» идут глутатион, полиамины, тиолы, свободные аминокислоты, например, таурин, лизин.

Неферментативное гликозилирование происходит в несколько этапов. Среди продуктов гликирования выделяют ранние (продукты Амадори) и поздние (или конечные) продукты гликирования. В начале в ходе реакции между альдегидной группой сахаров и аминогруппой образуется нестабильная альдиминовая группировка (основания Шиффа), которая может превращаться в ряд других, более стабильных соединений, ранних продуктов гликозилирования, т.н. Начинается этот процесс с того, что глюкоза и другие простые сахара соединяются с аминогруппой и запускают цепь дальнейших реакций. Одним из ранних продуктов присоединения глюкозы к белку является Nе–фруктозил–лизин, который, деградируя, в свою очередь, образует различные конечные продукты гликирования (КПГ). продуктов Амадори. Ещё одни хорошо изученные КПГ – Nδ–карбоксиметил–лизин (КМЛ) и Nδ–карбоксиэтил–лизин (КЭЛ), а также глюкозепан и пентозидин, характерные для перекрестных сшивок белков [3]. В наибольшем количестве в качестве КПГ образуются гидроимидазолоны, производные остатков аргинина, подвергшихся модификации глиоксалем, метилглиоксалем и 3–дезоксиглюкозоном (3–DG). Одним из наиболее легко определяемых видов КПГ является пентозидин, который накапливается, например, в сухожилиях больших мышц человека (то есть там, где скорость оборота коллагена замедлена) начиная с 20 лет и его концентрация линейно увеличивается к старости.

Но точное установление различной скорости внутри- и внеклеточного образования КПГ показало, что это не так. До недавнего времени считалось, что глюкоза – это основное вещество для образования КПГ. Описано негативное воздействие глицеральдегида на молекулу основного сократительного и цитоскелетного белка актина, приводящее к образованию пентозидиновых и битирозиновых сшивок и потери функциональности актина [4]. Более высокой скоростью внутриклеточного образования КПГ обладают такие сахара, как фруктоза, глюкозо-6-фосфат и глицералальдегид-3-фосфат.


Сшивание молекул коллагена глюкозепаном.

Белки, подвергшиеся гликированию в реакции Майяра, становятся афизиологично поперечно-сшитыми, теряя при этом свои свойства. Как сегодня предполагается, неферментативное гликозилирование и КПГ тесно связаны с целым рядом возраст-зависимых заболеваний, таких, как диабет, ревматоидный артрит, атеросклероз, болезнь Паркинсона и Альцгеймера, боковой амиотрофический склероз, катаракта и онкологические болезни [5]. Образовавшиеся дополнительные сшивки между молекулами нарушают функции этих белков, что приводит к потере эластичности тканей и часто наблюдается при старении и патологиях. Особенно большую проблему это представляет для долгоживущих белков (например, молекулы коллагена кожи, согласно ряду исследований, имеют период полужизни 15 лет, а хрящей — более 100 лет) которые составляют значительную часть всех белков в организме – около одной трети. Гликирование также становится причиной того, что и так медленно обновляемый белок коллаген становится еще более долгоживущим – после гликирования он приобретает резистентность к физиологическому действию эндогенных коллагеназ, которые обеспечивают обновление тканей.

(б) Показана химическая структура глюкозопана, которая сшивает лизин (синий) с аргинином (красный).
На иллюстрации (а) показана схема коллагеновой фибриллы и образование глюкозепана, который ковалентно связывает боковые цепи лизина и аргинина. (с) Показана молекулярная модель глюкозопана.

Гликирование последовательности арг-гли-асп белка фибронектина приводит к нарушению восстановительной способности сосудов и прогрессированию сосудистых патологий. Описано участие гликированного фактора роста фибробластов β-FGF в образовании фиброзов. Кристаллины, основные структурные белки хрусталика глаза, восприимчивы к гликированию и поперечному сшиванию. КПГ накапливаются в линзе и сетчатке глаза с возрастом. Гликированный гемоглобин, который используют для определения среднего уровня гликемии за последние 3 месяца, теряет способность переносить кислород в ткани, что негативно сказывается на многих химических процессах. Гликирование белков хрусталика приводит к возникновению катаракты.

Связано это с тем, что в процессе гликирования белков запускаются процессы автоокисления сахаров, сопровождающиеся повышением продукции активных форм кислорода (АФК). Также известно, что гликирование белков и образование КПГ сопровождается увеличением свободнорадикальной активности и перекисного окисления липидов, что вносит свой вклад в развитие возрастных болезней. Кроме этого, связывание КПГ с рецептором КПГ (RAGE) также приводит к образованию реактивных АФК и последующей активацией чувствительного к окислительному стрессу фактора транскрипции NF-kB, связанного с воспалением и атерогенезом.

Кроме того, взаимодействие КПГ-RAGE активирует NADPH-оксидазу (комплекс ферментов, который продуцирует супероксид), что увеличивает внутриклеточный окислительный стресс. В свою очередь, активация NF-κB увеличивает экспрессию RAGE, создавая цикл положительной обратной связи, который усиливает продуцирование промоторов воспаления. И здесь мы можем наблюдать целый ряд «порочных кругов» — циклов с положительной обратной связью. А увеличение окислительного стресса NADPH-оксидазой в ответ на взаимодействие AGE-RAGE активирует, в свою очередь, NF-κB.

Кроме этого, формирование в митохондриях и в других структурах под воздействием гликирования неразлагаемых КПГ может быть ответственно за реализацию такого феномена, как «метаболическая память». Гликирование белков дыхательной цепи митохондрий тоже вносит свой вклад в этот процесс: нарушение в работе дыхательной цепи служит постоянным источником супероксидных радикалов. Предполагается, что неразлагаемые КПГ играют в этом феномене основную роль [6]. Когда у больных диабетом 2 типа строгий контроль гликемии уже не предотвращает развитие осложнений, связанных с сердечно-сосудистыми заболеваниями.

Так, при гликозилировании коллагена происходит накопление во внесосудистом матриксе конечных продуктов этого процесса, которые организм воспринимает как чужеродные. Также при гликировании происходит увеличение воспалительных процессов. Из-за этого возникнет иммунный ответ, в ходе которого иммунные клетки – макрофаги – увеличат секрецию провоспалительных цитокинов (TNF-α, интерлейкина-6 и др.), которые известны своей способностью негативно влиять на резистентность к инсулину и атерогенез [7].

Более того, благодаря пролину молекулы коллагена проводят слабые электромагнитные волны, генерируемые клетками и тканями, и, возможно, в дополнение к механическим и химическим сигналам, формируют единую биоэлектрическую сигнальную систему организма. Кроме этого, «сшитые» белки меняют структуру (нанотопографию) и увеличивают жесткость внеклеточного матрикса и через механорецепторы мембраны и цитоскелет клеток совместно с сигнальными молекулами оказывают влияние на экспрессию генов, функцию клеток, тканей и организма в целом. Интересно отметить, что, меняя топографию среды или электромагнитное излучение, можно не только управлять клеточным циклом, но и превращать взрослые соматические клеток в стволовые без помощи вирусов с вектором факторов Яманака.

Так, «молодые» фибробласты стремительно стареют в старом матриксе и наоборот – «старые» клетки утрачивают признаки связанного со старением секреторного фенотипа в «молодом» матриксе. Даже незначительные изменения модуля сдвига и вязкоупругости межклеточной среды оказывают сильное влияние на клетки – «старый» внеклеточный матрикс может существенно ограничивать эффективность применения сенолитиков и терапии стволовыми клетками.

Считается, что главная из них для современного человека сегодня – это нездоровая пища. Какие есть причины возникновения гликированных белков и КПГ? Рекордсменом по количеству образованных КПГ считается поджаренный бекон. Поджаренная коричнево-чёрная корочка на продуктах как раз и представляет собрание КПГ, образовавшихся из-за термической обработки продуктов (жарки мяса, картофеля и т.п.) при высоких температурах. Известны продукты, которые, напротив, помогают противостоять накоплению КПГ – черная редька, редис, капуста брокколи, благодаря содержащемуся в них веществу сульфорафану. Кроме этого, потребление содержащих много быстрых углеводов продуктов (кондитерских изделий, сладких газированных напитков и пр.) также может способствовать гликированию белков и образованию КПГ. Табачный дым содержит гликотоксины, которые реагируют с остатками лизина и аргинина, формируя КПГ. Как это не удивительно, но вместе с гурманами регулярно снабжают себя повышенными дозами КПГ и курильщики. Вероятно, поэтому у курильщиков наблюдается хроническое воспаление дыхательных органов [8].

Хотя этот процесс медленный и незначительный, но существенно усиливается при повышенной концентрации свободных радикалов, при резистентности к инсулину, сахарном диабете и повышении уровня глюкозы в крови. Как было уже сказано, кроме воздействия внешних факторов, образование КПГ в норме также происходит эндогенно (то есть внутри организма) в физиологических условиях. Накапливаясь в организме, КПГ затягивают человека в «болото» патологических процессов, из которого потом не так просто выбраться.

Решением этой проблемы авторы SENS видят в разработке лекарств, которые смогут реагировать с поперечными сшивками и разрывать их, не разрушая других структурных особенностей молекул. По образному выражению авторов SENS, белковые сшивки действуют как молекулярные «наручники», связывающие молекулы белков, нарушая этим их функцию. Что должно облегчить поиск и создание терапевтических средств. По их мнению благоприятным обстоятельством в этом процессе является то, что сшивки, которые происходят как химические аварии в структурах наших белковых молекул, имеют очень необычное химическое строение, которое в норме не встречается в веществах, производимых организмом.

Такие, как поиск или разработка ферментов, вместо лекарств, для разрушения сшивок. Кроме этого, авторы SENS определяют ещё ряд перспективных подходов для решения данной проблемы. Известно, что такие белки существуют для других целей, например, регенерирующий ДНК белок MGMT [9]. А также разработка «одноразовых» белков, которые разрушали бы сшивку, и потом сами были бы уничтожены в процессе. Так у грибов и бактерий найдены противостоящие гликированию ферменты амадориаза, фруктозолизин-6-киназа frlD и фруктозолизин-6-фосфат-дегликаза frlB, действующие на низкомолекулярные соединения аминокислот с сахарами [10]. В пользу подхода по поиску ферментов, говорит тот факт, что у живых организмов описаны дегликирующие ферменты. У позвоночных обнаружены ферменты фруктозамин-3-киназа (FN3K) и родственный ей белок FN3K-RP, которые в состоянии расщеплять продукты гликирования внутриклеточно, в АТФ-зависимых процессах [11].

Считается, что глюкезепан, оказывает наибольшее влияние на течение болезней пожилого возраста человека и поэтому является приоритетной мишенью для противовозрастной терапии.

Эти вещества были нацелены на нейтрализацию карбоксиметиллизина – самого распространённого позднего продукта реакции Майяра, накапливающемся в организме при диабете. К сожалению, глюкозепан не был выбран целью для ранее разработанных препаратов против поперечных сшивок, таких как Alagebrium/ALT-711 (Wolffenbuttel et al., 1998), C36 (Cheng et al., 2007), vTRC4149 (Pathal et al., 2008), и ему только предстоит доказать свою роль в механизмах старения.

Обри де Грей подтверждает важность исследований по глюкезепану и недавно сообщил о регистрации компании Revel, на базе которой, возможно, будут продолжены начатые в университете исследования. На данный момент группа Дэвида Шпигель из Йельского университета работает над синтезом антител против содержащих глюкозепан белков.

Более того, разорванные поперечные сшивки коллагена восстанавливаются после окончания приема препарата, что будет требовать повторный курс терапии. Однако, есть вероятность, что ни антитела, ни энзимы, по причине своих размеров, не смогут проникнуть между фибриллами коллагена.

Подобные молекулы с заданной каталитической активностью – спиролигомеры (spiroligomeres) разрабатывает группа Христиана Шафмейстер из Темпльского университета. Поэтому искусственные энзимонтоподобные катализаторы, размеры которых может быть в несколько раз меньше размеров оригинальных энзимов – видятся более интересной альтернативой.

Однако, как детектирование КПГ в организме, так и ранняя диагностика изменений состава и структуры межклеточного матрикса затруднены по причине ограниченного органами и системами характера изменений и необходимостью проведения множественной биопсии. Как было замечено ранее, поскольку конечные продукты гликирования накапливаются во время старения, их количественное определение может быть точным и надежным биомаркером старения. Даже в одном организме результаты сильно отличаются в зависимости от места взятия биопсии и исследуемого вида конечных продуктов гликирования.

Доступные методы определения конечных продуктов гликирования в коже, такой как аутофлуоресценция, то есть без применения специальных красителей (прибор «AGE-READER», изготавливаемый голландской компанией DiagnOptics BV) не дают точных данных и на результаты измерений могут влиять многие факторы, например, изменения водно-солевого баланса организма.

Масс-спектрометрия позволяет идентифицировать белки с высокой степенью достоверности и определять их количества в сложных белковых смесях. Основным и наиболее точным методом количественной оценки КПГ в организме сегодня считается метод хроматографии в сочетании с масс–спектрометрической детекцией.

Но этот метод имеет ряд качественных ограничений (недостаточная специфичность антител, влияние свободных продуктов гликирования и пр.). Также для определения уровня КПГ используется иммуноферментный анализ. КПГ также можно идентифицировать по общей интенсивности их флуоресценции. Поэтому считается, что целесообразно проводить его в сочетании с масс–спектрометрией. Что тоже имеет свои ограничения (большинство КПГ количественно не флуоресцируют, поэтому не могут быть определены) и позволяет более точно определять низкомолекулярные пептиды КПГ и свободные продукты гликирования.

КМЛ является одним из доминирующих КПГ в организме, как циркулирующих, так и тканевых. Одним из перспективных биомаркеров, показывающих не только накопление КПГ, но и увеличение риска смертности от всех причин, является плазменный карбоксиметил-лизин (КМЛ). Связывание RAGE с КМЛ приводит к увеличению генерации свободных радикалов, активации пути ядерного фактора Nf-κB и повышению уровня медиаторов воспаления (таких, как фактор некроза опухоли-альфа, интерлейкин-6 и C-реактивный белок). Кроме этого, КМЛ является единственным КПГ, который выступает лигандом для рецепторов КПГ (RAGEs). И высокие концентрации этого КПГ в сыворотке связаны с большей артериальной жесткостью, мощным фактором риска развития сердечно-сосудистых патологий и смертности от них, что было показано в ходе Балтиморского продольного исследования старения [12]. Известно, что КМЛ накапливается в больших кровеносных сосудах с возрастом.

В рамках 6-летнего исследования Invecchiare in Chianti, в котором приняли участие 1. Также известно, что пожилых людей с церебрально-сосудистыми заболеваниями повышенный уровень КМЛ обнаруживается в кортикальных нейронах и сосудах головного мозга, что связано с тяжестью когнитивных нарушений. В 2018 году группа датских и шведских учёных описала новое моноклональное антитело, D1-B2, нацеленное на КМЛ, которое имеет хороший потенциал при иммуноферментном анализе для обнаружения данного КПГ. 013 человека старше 65 лет, было показано, что средняя концентрация КМЛ в плазме, которую измеряли иммуноферментным анализом, была значительно выше у тех людей, которые умерли от всех причин, чем у выживших [13]. [14]

Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии позволяет детектировать ещё два класса КПГ, связанных со старением и диабетом – GOLD и MOLD [16]. Ранее при помощи метода связанной жидкостной хроматографии вместе с масс-спектрометрией были идентифицированы ряд КПГ (глюкозепан, DOGDIC, MODIC и GODIC), которые накапливаются в тканях при старении и патологиях и могут использоваться в качестве маркеров для патофизиологических процессов [15].

Авторы обзора: Денис Одиноков, Алексей Ржешевский.

Список литературы:

  1. Krištić J, Vučković F, Menni C, Klarić L, Keser T, Beceheli I, Pučić-Baković M. et al. Glycans are a novel biomarker of chronological and biological ages.Gerontol A Biol Sci Med Sci. 2014 Jul;69(7):779-89.
  2. Bürkle A, Moreno-Villanueva M, Bernhard J, Blasco M, Zondag G, Hoeijmakers JH6, Toussaint O, Grubeck-Loebenstein B, Mocchegiani E, Collino S, Gonos ES, Sikora E. et al. MARK-AGE biomarkers of ageing. Mech Ageing Dev. 2015 Nov;151:2-12.
  3. Ahmed N., Thornalley P.J. Роль конечных продуктов гликирования в патогенезе осложнений сахарного диабета. Российский медицинский журнал. 2009. №9, стр. 642-51.
  4. Федорова М. А., Благовещенский И. Ю., Филимонов В. Б., Кулева Н. В. Неэнзиматическая модификация актина in vitro под влиянием факторов окислительного, гликоокислительного и нитрозактивного стрессов. Вестник СПбГУ. 2006, №2, с. 51-59.
  5. Ансари Н.А., Рашид З. Неферментативное гликирование белков: от диабета до рака. Биомедицинская химия, 2010, том: 56(2), 168-178.
  6. Герасименко О.А. Конечные продукты избыточного гликозилирования как потенциальная мишень «выключения» метаболической памяти. Эффективная фармакотерапия. Эндокринология. 2011. № 4.
  7. Bernheim J, Rashid G, Gavrieli R, Korzets Z, Wolach B. In vitro effect of advanced glycation end-products on human polymorphonuclear superoxide production. Eur J Clin Invest. 2001. Dec;31(12):1064-9.
  8. Mullick AE, McDonald JM, Melkonian G, Talbot P, Pinkerton KE, Rutledge JC. Reactive carbonyls from tobacco smoke increase arterial endothelial layer injury. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2002 Aug;283(2):H591-7.
  9. GlycoSENS: Breaking extracellular crosslinks.
  10. Monnier VM, Sell DR. Prevention and repair of protein damage by the Maillard reactionin vivo. Rejuvenation Res. 2006;9(2):264–273.
  11. Szwergold BS1, Bunker RD, Loomes KM. The physiological substrates of fructosamine-3-kinase-related-protein (FN3KRP) are intermediates of nonenzymatic reactions between biological amines and ketose sugars (fructation products). Med Hypotheses. 2011 Nov;77(5):739-44.
  12. Semba RD, Najjar SS, Sun K, et al. Serum carboxymethyl-lysine, an advanced glycation end product, is associated with increased aortic pulse wave velocity in adults. Am J Hypertens. 2009;22:74–79
  13. Semba, R. D., Bandinelli, S., Sun, K., Guralnik, J. M., & Ferrucci, L. (2009). Plasma Carboxymethyl-Lysine, an Advanced Glycation End Product, and All-Cause and Cardiovascular Disease Mortality in Older Community-Dwelling Adults. Journal of the American Geriatrics Society, 57(10), 1874–1880.
  14. Wendel U, Persson N, Risinger C, Bengtsson E, Nodin B, Danielsson L, Welinder C, Nordin Fredrikson G, Jansson B, Blixt O. A novel monoclonal antibody targeting carboxymethyllysine, an advanced glycation end product in atherosclerosis and pancreatic cancer. PLoS One. 2018 Feb 8;13(2):e0191872.
  15. Biemel KM, Fried DA, Lederer MO. Identification and quantification of major maillard cross-links in human serum albumin and lens protein. Evidence for glucosepane as the dominant compound. J Biol Chem. 2002 Jul 12;277(28):24907-15. Epub 2002 Apr 26.
  16. Chellan P, Nagaraj RH. Protein crosslinking by the Maillard reaction: dicarbonyl-derived imidazolium crosslinks in aging and diabetes. Arch Biochem Biophys. 1999 Aug 1;368(1):98-104.
Теги
Показать больше

Похожие статьи

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

Кнопка «Наверх»
Закрыть