Хабрахабр

Прощай, простуда: внедрение препаратов в «карманы» вирусов

Хочется джинсы сменить на шорты, ноутбук на волейбольный мяч, а офис на пляж. За окном светит яркое солнце, воздух наполнен теплой влагой, а спасительный прохладный ветерок решил взять отпуск, оставив нас на растерзание жары. Нет ничего хуже температурить, когда температура воздуха около 30. Лето ассоциируется с отпусками и каникулами, но порой в этот праздный перечень втискивается гость, которого мы обычно ждем в зимние месяцы, а именно простуда. ОРВИ летом превращают человека в улитку, медленно плетущуюся по раскаленному асфальту, оставляя за собой склизкий след.

Конечно может, ответят вам ученые, обнаружившие новый способ борьбы с рино-/энтеровирусами сокрытый в ранее неисследованном «кармане» вируса. Может ли спасительная наука помочь нам в борьбе с риновирусами, спросите вы? Ответы мы найдем в докладе исследовательской группы. Что это за карман, что в него хотят засунуть ученые и как это поможет победить риновирусы?

Основа исследования

Для начала быстренько вспомним от чего у нас возникает ОРВИ и что это вообще такое.


Визуализация риновируса.

К таким вирусам относят риновирусы из рода энтеровирусов. ОРВИ, то есть острая респираторная вирусная инфекция, это результат активной деятельности вируса в организме человека, а именно в его дыхательной системе. Одной из основных структурных особенностей риновируса является открытый вирион, то есть вирусная частица без оболочки.

Симптоматика в случае инфицирования достаточно стандартная и всем знакомая — температура, насморк, болевой синдром в области гортани. У человека риновирусы вызывают воспалительные процессы верхних дыхательных путей, ибо предпочитают размножаться в слизистой оболочке, покрывающей носоглотку. В случае отсутствия лечения и пониженной иммунной ответной реакции организма ОРВИ может перерасти в бронхит, синусит или отит.

Теоретически можно, но практически невозможно, так как число серологических вариантов возбудителя очень велико. Можно ли лечить риновирусы и/или сделать прививку от них? Лечение риновирусных инфекций осуществляется путем ослабления симптоматики, а сам вирус побеждает иммунная система.

Как правило, это осуществляется посредством внедрения в него лекарственного препарата, грубо говоря. Если же говорить про лечение вирусной инфекции как таковой, то стоит понять сам процесс уничтожения вируса. На данный момент самыми изученными ингибиторами являются капсидные связующие, которые помещаются в гидрофобный карман вирусного капсида.

Внедрение лекарства в этот карман позволит стабилизировать ключевую область вириона, что предотвратит конформационное расширение, необходимое для высвобождения вирусной РНК. В рассматриваемом нами сегодня исследование ученые выявили ранее неизвестный карман, который формируется вирусными белками VP1 и VP3 и является общей чертой для разных видов энтеро-/риновирусов. Согласитесь, звучит очень воодушевляюще. Следовательно, никаких соплей, кашля и температуры.

Результаты исследования


Изображение №1

Полумаксимальная эффективная концентрация (EC50) составляет 0. Ученые установили, что соединение 17 (), являющееся производным бензолсульфонамида, это достаточно мощный ингибитор для B3 штамма вируса Коксаки. 1 мкМ (1b). 7 ± 0.

Также данное соединение не ингибируется в CVA16 и EVA71 (группа EV-A), CVA21 и PV1 (группа EV-C), EVD68 (группа EV-D) и риновирусе B14 (RVB14, RV-B). Соединение 17 также ингибирует репликацию CVB1 и CVB6, проявляет умеренную активность против CVB4, CVB5 и вируса Коксаки А9 (CVA9), но не реагирует против CVB2 даже при самой высокой протестированной концентрации (1b).

Противовирусная активность соединения 17 была дополнительно подтверждена в анализе вирусной нагрузки, в котором оно уменьшало дозозависимым образом образование РНК вирусов CVB3 и CVB3 со значениями ЕС50 0,4 ± 0,01 мкМ и 1,1 ± 0,3 мкМ соответственно ().

В случае внедрения соединения 17 спустя 2 часа после заражения противовирусная активность сильно снижается (1d). Соединение 17, как и плеконарил (противовирусный препарат), нацеливается на репликацию CVB3 на ранней стадии вирусного цикла.

Соединение 17 повысило термостабильность CVB3 на 1,5 при температуре 46˚C и на 2,1 при 49˚C (). Ученые напоминают нам, что ингибиторы энтеровирусов ранней стадии (например, плеконарил) взаимодействуют с вирусными капсидами и повышают их устойчивость к тепловой инактивации.

То есть эти два вещества обладают разными механизмами противовирусного действия (1f). Если же объединить соединение 17 и плеконарил, то будет наблюдаться синергетическая противовирусная активность.

Данные наблюдения позволяют сделать вывод, что соединение 17 достаточно хорошо подходит для проведения тестов, связанных с обнаруженным карманом в вирусном капсиде.

Дабы лучше рассмотреть процесс взаимодействия соединения 17 и вирусного капсида CVB3 ученые провели криоэлектронную микроскопию.


Изображение №2

Кроме того, крио-ЭМ штамма Nancy показал отсутствие уплотнения липидного фактора в гидрофобном кармане VP1. Боковые цепи капсидного белка были легко идентифицированы, и модель гомологии CVB3 Nancy могла бы легко вписаться в карту уплотнений. Тем не менее, анализ различий выявил дополнительное уплотнение, которое можно связать с атомарной моделью соединения 17 (, ).

Моделирование показало, что соединение 17 связывается в кармане посредством двух блоков VP1 и одного блока VP3 на межпротомерном интерфейсе. Как видно на изображении 2b, компаунд имеет L-образную форму с длинным и коротким плечом, что позволяет реализовать «стыковку» с соединением 17. Ввиду икосаэдрического типа симметрии вируса в одном каспиде может быть 60 таких областей ().

Таким образом, соединение 17 работает не там же, где и плеконарил, то есть не мешая его противовирусной активности, а дополняя ее. Рассматриваемая область находится на расстоянии в 16 Å от гидрофобного кармана, на который нацелен плеконарил.

Ученые провели моделирование взаимодействий внутри белков, интерфейсов, структур и соединений, которое показало остатки VP1 (73, 75–78, 155–157,159–160, 219 и 234) и VP3 (233–236), которые формируют карман (2d и 2e).

внутри есть соединение 17), а примерно 14 остатков показывали результат в 97% консервации. Анализ консервации этих карманных остатков в 56 аминокислотных последовательностях CVB3 показал, что 7 из 16 полностью консервированы (т.е. Консервация кармана также происходит и во всех энтеровирусах группы В.

Посему необходимо было понять, что делает их такими устойчивыми. Однако далеко не все вирусы так просто поддаются ингибированию соединением 17. Три из четырех аминокислотных мутаций были расположены в непосредственной близости от кармана (F76C, E78G и A98V), и еще одна (D133G) была достаточно отдалена. Для этого ученые провели клоновую селекцию, выделив 4 мутации устойчивости.


Степень влияния соединения 17, рупинтривира (ингибитор 3C-протеазы) и TP0219 (глутатион-истощающего соединения) на репликацию CVB3 WT и модифицированные CVB3 варианты.

Также был создан глутатион-независимый вариант VPB1_T77M CVB3, устойчивый к глутатион-истощающему соединению TP0219. Ученые подготовили 12 мутантов CVB3 в клоне CVB3 посредством обратного инжиниринга.

Лишь восемь из 12 мутантов оказались жизнеспособными (2d), 7 из них оказались устойчивыми к соединению 17 и одинаково реагируют на рупинтривир.

То есть VP1_D133G является компенсаторной мутацией, а не мутацией, которая предотвращает привязку соединения 17. Исследование единственной отдаленной от кармана резистентной мутации продемонстрировало, что VP1_D133G более устойчив к теплу, чем CVB3 Nancy, а соединение 17 все еще может его стабилизировать.

Анализ показал, что глутатион-независимый вариант VP1_T77M CVB3 обладает пониженной чувствительностью к соединению 17. А вот VP1_T77 участвовал в связывании глутатиона. Также было установлено, что этиловый эфир глутатиона никак не влиял на противовирусную активность соединения 17 даже при самой высокой протестированной концентрации.

Для этого были использованы белок человеческого вируса Коксаки и рецептор аденовируса (hCAR), связанные в цепочку. Далее ученые проверили степень потенциального влияния соединения 17 на связывание вирусных рецепторов. Кроме того, соединение 17 было активным в отношении CD55-зависимого* энтеровируса B (E-11 вирус). Аффинность связывания CVB3 не снижалась в присутствии соединения 17 даже при самой высокой протестированной концентрации.

CD55 (фактор ускорения распада комплемента)* — мембранный белок, ингибитор системы комплемента.

Экспериментальные данные также подтверждаются и тем, что участки связывания рецептор Коксаки + вирус аденовируса и CD55 + CVB3 не пересекаются с карманом.

Следующий этап исследования это проверка эффективности внедряемого в данный карман препарата. Таким образом, ученые установили, что соединение 17 прекрасно внедряется в карман капсида различных вирусов.


Изображение №3

Во время этой проверки были использованы как коммерчески доступные вещества (соединения 20-50), так и изготовленные в лаборатории модификации — соединения 51-81.

Ученые проанализировали информацию из противовирусных анализов и использовали ее в синтезе более активных аналогов соединения 17. Знания касательно активности соединения 17 позволили вычленить конкретные характеристики, необходимые для будущего препарата.

К сожалению, ни одно из созданных соединений не было активно против вирусов EVA (CVA16 и EVA71). Результатом синтеза стали аналоги, которые проявляли активность против ряда энтеровирусов: EV-B (CVB), EV-C (PV1 и CVA21), EV-D (EVD68), RV-A (RVA09, RVA59 и RVA63) и RV-B (RVB14) ().


Соединения с максимальной потенциальной активностью относительно тех или иных вирусов.

Соединение 48 полностью ингибировало репликацию PV1 при концентрации 144 мкМ. Среди всех аналогов соединения 29 и 48 проявили активность против всех 6 протестированных CVB (вирусы Коскаси группы В). Против RV-A и RV-B противовирусную активность проявило соединение 77.

Ученые смогли установить четкое соотношение структура-свойство (химическая структура молекулы к ее биологической активности) из карбоксильной группы в положении R3, где атом водорода необходим для противовирусной активности, и в положении R2, где гидроксильная группа демонстрирует свою пользу для широкого противовирусного действия. Как видно на изображении №3, форма новых молекул дополняет форму кармана. Крио-EM структурирование показало, что существует комплементарность заряда между R3 и ингибированным остатком VP1_R234.

Совокупность результатов проведенных тестов говорит о достаточно высокой степени внедрения тестируемых соединений в карманы капсидов вирусов из различных групп.

Для более детального ознакомления с нюансами исследования рекомендую заглянуть в доклад ученых (тут или тут)

Эпилог

Подводя итоги, ученые выявили в структуре энтеровирусов карманы, которые можно заполнить лекарственными препаратами, предотвращающими распространение вируса или полностью его уничтожающими.

Выявленные карманы достаточно схожи между собой в разных группах вирусов, что позволяет в дальнейшем разработать препараты широкого спектра действия. Главным героем стало соединение 17 и его модифицированные аналоги, которые проявили высокую степень активности против CVB3.

Конечно, полагаться исключительно на иммунную систему человека — не самая здравая идея, учитывая ряд заболеваний и отклонений, которые могут нарушить ее работу, открывая двери в организм человека самым разным вирусам. Другими словами, вирусы, которые ранее никто не лечил, теперь можно будет легко побороть. А эти показатели очень сильно влияют на скорость распространения вирусных инфекций. Подобные исследования и разработки крайне важны в наше время, учитывая рост населения планеты и скорость урбанизации. и т.п.). К тому же, имея препарат, способный побороть вирус в корне, человеку не понадобится бороться с каждым симптомом по отдельности, то есть покупать кучу других лекарств (капли, спреи, таблетки, суспензии и т.д.

Нам остается только пожелать им удачи и, пока они не довели дело до конца, бороться с простудой своими силами. Ученые продолжат свою работу, сконцентрировав свое внимание на поиске соединений, которые будут максимально эффективны против максимально возможного числа вирусов.

Пятничный офф-топ:

Не только люди страдают от вирусов, но и компьютеры, а порой и анимированные персонажи. (Вторая серия тут.)

🙂
Благодарю за внимание, оставайтесь любопытствующими, берегите здоровье и отличных всем выходных.

Вам нравятся наши статьи? Спасибо, что остаётесь с нами. Поддержите нас оформив заказ или порекомендовав знакомым, 30% скидка для пользователей Хабра на уникальный аналог entry-level серверов, который был придуман нами для Вас: Вся правда о VPS (KVM) E5-2650 v4 (6 Cores) 10GB DDR4 240GB SSD 1Gbps от $20 или как правильно делить сервер? Хотите видеть больше интересных материалов? (доступны варианты с RAID1 и RAID10, до 24 ядер и до 40GB DDR4).

6GHz 14C 64GB DDR4 4x960GB SSD 1Gbps 100 ТВ от $199 в Нидерландах! Dell R730xd в 2 раза дешевле? Только у нас 2 х Intel TetraDeca-Core Xeon 2x E5-2697v3 2. 2Ghz 6C 128GB DDR3 2x960GB SSD 1Gbps 100TB — от $99! Читайте о том Как построить инфраструктуру корп. Dell R420 — 2x E5-2430 2. класса c применением серверов Dell R730xd Е5-2650 v4 стоимостью 9000 евро за копейки?

Теги
Показать больше

Похожие статьи

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

Кнопка «Наверх»
Закрыть