Главная » Хабрахабр » «Невидимые» мухи: новый метод изучения нервной системы посредством депигментации тканей

«Невидимые» мухи: новый метод изучения нервной системы посредством депигментации тканей

Современные методы сканирования преуспели в этом. Исследование какого-либо организма — процесс сложный и требующий точности. Лет 100 назад трехмерный вид органов можно было получить только вынув их из организма и рассмотрев в живую, так сказать. Сегодня мы можем достаточно детально изучить организм или отдельный орган на трехмерных изображениях. Но даже самые точные сканеры и микроскопы не могут дать 100% точности. Однако всегда есть какое-то «но». Звучит, как научная фантастика, не правда ли? Вот если бы можно было сделать все ненужное невидимым, а ту часть организма, которую мы хотим изучить, оставить видимой. Но теперь это реально. Согласен. Как ученым удалось сделать обычную фруктовую мошку «невидимой», насколько точен их метод сканирования и как это поможет в диагностике заболеваний человека? Сегодня мы с вами будем знакомиться с исследованием нового метода сканирования организмов на примере дрозофилы. Так не будем же тянуть. Ответы на эти и другие вопросы мы можем получить только в докладе исследователей. Поехали.

Основа исследования

С ее помощью ученые изучают довольно много вещей: от аэродинамики до нервной системы. Как я уже говорил в одной из предыдущих статей, главной героиней которой, как и сегодня, была дрозофила, — это маленькое и, по правде говоря, надоедливое насекомое является объектом множества исследований. Изучение столь сложных систем в столь малых организмах сопряжено с определенными сложностями. И именно о последнем пойдет речь сегодня. Такой метод дает возможность изучить многие системы более детально. Нам уже знакомы методы изучения организмов путем их разрезания на множество ультратонких слоев. Однако касательно нервной системы сей метод, по словам исследователей, нарушает клеточную целостность, что усложняет процесс исследования отдельных участков системы.

Но ученые хотят исследовать только одну систему, при этом другие не должны мешать этому процессу. Если применять сканирование на малых организмах без физического «слоирования», мы будем видеть все системы одновременно. Потому им пришла гениальная и простая идея — сделать все невидимым (точнее прозрачным), а нужную систему оставить нетронутой.

Основными ингредиентами нового метода сканирования под названием FlyClear (в честь первого испытуемого — мухи дрозофилы) являются «очистка» тканей и ультрамикроскопия. На данный момент инструментов для реализации подобной идеи достаточно, остается лишь объединить их вместе.

Основой большинства методов очистки тканей является генетическая модификация испытуемого организма. Дрозофила была выбрана в качестве испытуемого не просто так. Этот процесс крайне сложен и требует много времени. В данном случае это флуоресценция. К тому же, далеко не все существа можно модифицировать так, как этого хотят ученые. Чем организм больше, тем больше времени уйдет на его модификацию. Дрозофила же поддается подобным генетическим манипуляциям довольно легко, а процесс этот занимает не так много времени.

Возникает вопрос — а если не проводить рассечение? На данный момент самым популярным методом исследования организмов является конфокальная микроскопия, но производится она только после рассечения тканей. Также будет наблюдаться сильное поглощение и рассеяние фотонов в образце, особенно с повышенной пигментацией тканей (как у дрозофилы). В таком случае мы получим низкокачественное бледное изображение, а сам процесс займет уйму времени. Тем самым нивелировать снижение интенсивности сигнала и достичь равномерности пространственного разрешения. Соответственно, образец необходимо очистить, то есть сделать прозрачным. Основным способом «опрозрачивания» (простите за выдуманное слово) тканей является снижение показателя преломления на границах между клеточными компонентами.

Однако, они также заявляют о наличии у этих способов ряда недостатков. Исследователи не отрицают, что сейчас существует несколько способов, ставших уже классическими, сделать ткани прозрачными. К тому же, ни одна из них не дает полной депигментации тканей. Сохранение морфологии, стабильность флюоресценции, глубина сканирования и прочее — со всеми этими аспектами у существующих методик, мягко говоря, не лады.

Не совсем. Выходит для лучшего сканирования малых тел все же необходимо проводить поперечное сечение тканей? Расположенные в ее периферических регионах (лапки, глаза, усики), сенсорные нейроны дрозофилы обладают очень длинными соединениями с многочисленными нервами и с мозгом. Ученые приводят в пример все ту же дрозофилу. Если эти регионы подвергнуть слоированию, то мы не получим полной картины того, как устроена нервная система в этих регионах.

На это потребовалось около месяца. В данном исследовании метод FlyClear позволил убрать пигментацию тканей дрозофилы, оголив ее нервную систему. Также большую роль сыграло вещество, с помощью которого получилось «окрасить» нервную систему в ярко-зеленый цвет — зеленый флуоресцентный белок (далее ЗФБ). А ультрамикроскопия позволила визуализировать самые мелкие нейронные соединения и построить полную карту нервной системы мошки. Ген данного белка, полученного из медузы Aequorea victoria, используется именно для генной модификации испытуемых образцов.


Медуза Aequorea victoria.

Данные, полученные посредством флуоресцентной микроскопии, обрабатывались специальным алгоритмом, позволяющим создавать трехмерное изображение с высоким разрешением.

Подготовка к исследованию

Хитиновый экзоскелет и фотопигменты фасеточных глаз являются самыми сложными регионами тела мошки для проведения процедуры. Оптическая очистка тканей дрозофилы — непростой процесс. Имеющиеся на данный момент методы тканевой очистки далеки от идеала, потому исследователи создали свой — FlyClear, о нем я упоминал ранее.

Первым из них в процессе является CUBIC (clear, unobstructed brain imaging cocktails). FlyClear совмещает в себе сразу несколько предшествующих методов. Дальнейшие шаги зависят от состояния образца (личинка или взрослая особь).


Варианты процедуры FlyClear.

03% протеаза и формальдегидная фиксация. В случае личинки используется 0. Далее на образце применяют ацетон для проведения пермеабилизации (изменения проницаемости оболочки клетки). Дело в том, что протеаза расщепляет пептидные связи между аминокислотами белков, а это помогает «обесцветить» ткани.

Это изменение позволило достичь полной депигментации тканей, в том числе и в сложных участках (глаза и эпидермис). Ученым удалось усовершенствовать этап CUBIC, заменив [CH3CH(OH)CH2]2NCH2CH2N[CH2CH(OH)CH3]2 (N, N, N ', N'-тетракис (2-гидроксипропил) этилендиамин) на C10H24N2O4 (2,2 ', 2 ", 2"' — (этилендинитрило) -тетраэтанол)).

Теперь необходимо проверить второй важный этап исследования — флюоресценцию. Итак, метод полной депигментации тканей работает. Для теста образцы (тела дрозофил) были разделены пополам: одна половина была без обработки, вторая — с обработкой. Точнее необходимо проверить будет ли новый реагент C10H24N2O4 подавлять сигналы флуоресценции, учитывая что дрозофилы и так обладают низкой флуоресценцией после генетических манипуляций. А все благодаря тому, что этот же реагент позволил достичь высокой степени депигментации тканей. Анализ показал, что уровень выраженности ЗФБ и правда снижается при использовании C10H24N2O4, однако на общую точность это не влияет. То есть, плюсы реагента нивелировали его недостатки.

Готовый образец необходимо, так сказать, рассмотреть, а для этого использовалась усовершенствованная ультрамикроскопия, позволяющая получить изображение образца с одинаковым разрешением во всех плоскостях.


Оптическая система: 1 и 3 — плоско-выпуклая асферическая цилиндрическая линза; 2 — линза Пауэлла; 4 — эллиптическая аподизирующая мягкая апертура; 5 и 6 — ацилиндрические линзы.

В данном же исследовании были использованы дополнительные составляющие, которые изменяют форму луча на ультратонкий с улучшенными характеристиками. Как правило, в стандартной ультрамикроскопии используют цилиндрические линзы и прямоугольную апертуру.

Использование сферических линз обусловлено возможностью получить изображение без искажений и с минимальной аберрацией.

Новая апертура позволила элиминировать нежелательное распределение интенсивности в оптической системе. Стандартная апертура также была изменена на эллиптическую аподизирующую мягкую апертуру (на изображении выше под номером 4).

Результаты исследования

Ниже представлены определенные системы организма дрозофилы (дыхательная, зрительная, нервная и т.д.), подсвеченные ЗФБ, в то время как остальные ткани полностью депигментированы.

Дабы не растягивать статью, все спрятал под спойлер.

Третья стадия личинки: трахея, пищеварительная система и слюнные железы.

Предкуколка: развивающаяся зрительная система и иннервация сегментных нервов в брюшную нервную цепь.

Конечности взрослой дрозофилы.

Спинальный ганглий.

Куколка: зрительная и обонятельная системы.

Сенсорные нейроны глаз, усиков, максилл (вторая пара челюстей) и лабеллум, а также их соединения с центральной нервной системой взрослой особи.а

Связь усикового нерва и усиковой доли у взрослой особи.

Взрослая особь дрозофилы.

Ученые без стеснения называют самым большим достижением своего исследования возможность создавать полноценную трехмерную карту нервной системы. А если учесть, что эта система принадлежит столь малому организму (дрозофиле), то такое достижение становится еще более значимым.

Если бы использовалось поперечное сечение, такого бы достичь не удалось. Новая методика позволяет точно определить где и как соединяются те или иные нейроны, как между собой, так и с мозгом.

В дорсо-латеральной области мозга DCN кластеры образуют комиссуральные соединения для возбуждения синаптических нейронов медуллы и лобулы в оптической доле. В качестве демонстрации возможностей своего метода ученые показывают нам два типа нейронов зрительной системы дрозофилы: DCN — дорсальные кластерные нейроны и MCN — мозговые столбчатые нейроны (колонки кортекса в заднем отделе мозга). (изображения выше а, с).

Эти изменения нервной системы связаны именно с процессом клеточной очистки FlyClear. На изображениях b и d видна потеря комиссурального соединения у гомозиготных мутантов нейронных клеток Neuroglian.

Алгоритм на базе 3D FFT определяет детали образца, которые выглядят более четка в одном из двух стеков снимков. Для построения трехмерной реконструкции были сделаны снимки с двух ортогональных направлений, которые после были объединены. Далее все это объединялось воедино в одну трехмерную реконструкцию.

Желающие более детально ознакомится с исследованием могут почитать доклад ученых и дополнительные материалы к нему.

Эпилог

Метод слоирования путем поперечного сечения был доминирующим в сфере исследований организмов. Ученые не зря хвастаются и гордятся своим трудом, ибо подобного ранее не было. В частности, разрезы нарушают клеточную и тканевую целостность, тем самым усложняя процесс реконструкции той или иной системы организма. Но такой метод, хоть и имеющий много преимуществ, обладает огромными недостатками.

Ученые смогут получить больше данных, что позволит им более детально описать те или иные процессы в организме. Исследовать организм со сложной нервной системой, когда важна каждая деталь, теперь будет значительно проще.

Совершенствование нового метода сканирования может послужить и человеку. Также не стоит забывать, что дрозофилы это лишь подопытные в данном исследовании, а не его основа. И не только для изучения тела и его составных элементов, но и для диагностики заболеваний, которые на ранних этапах могут прятаться там, где имеющиеся на данный момент методы сканирования не могут их определить.

Но без исследований, направленных на создание инструментов исследований, все это было бы невозможно. Исследования открывают много нового: новые виды животных, новые вещества, процессы и явления.

И, конечно же, пятничный оффтоп:

Сегодня в свете софитов опять были мухи. А где мухи, там и пауки. Но далеко не все пауки страшные на вид. Некоторые из них даже весьма неплохо танцуют.

Надеюсь это видео заставило вас улыбнуться (и может даже начать чуть меньше боятся пауков).

Спасибо за внимание и хороших вам выходных, ребята.

Спасибо, что остаётесь с нами. Вам нравятся наши статьи? Хотите видеть больше интересных материалов? Поддержите нас оформив заказ или порекомендовав знакомым, 30% скидка для пользователей Хабра на уникальный аналог entry-level серверов, который был придуман нами для Вас: Вся правда о VPS (KVM) E5-2650 v4 (6 Cores) 10GB DDR4 240GB SSD 1Gbps от $20 или как правильно делить сервер? (доступны варианты с RAID1 и RAID10, до 24 ядер и до 40GB DDR4).

VPS (KVM) E5-2650 v4 (6 Cores) 10GB DDR4 240GB SSD 1Gbps до 1 января бесплатно при оплате на срок от полугода, заказать можно тут.

класса c применением серверов Dell R730xd Е5-2650 v4 стоимостью 9000 евро за копейки? Dell R730xd в 2 раза дешевле? Только у нас 2 х Intel Dodeca-Core Xeon E5-2650v4 128GB DDR4 6x480GB SSD 1Gbps 100 ТВ от $249 в Нидерландах и США! Читайте о том Как построить инфраструктуру корп.


Оставить комментарий

Ваш email нигде не будет показан
Обязательные для заполнения поля помечены *

*

x

Ещё Hi-Tech Интересное!

Перевезти дата-центр за 14 400 секунд

Всем знакома пословица «Один переезд равен двум пожарам». Смысл этой народной мудрости в том, что процесс переезда сопряжен со стрессами, суетой, переживаниями и, конечно, беготней, которые бывают и при пожаре, а подчас и с утратами ценного имущества. К тому же, ...

Дорожная карта математических дисциплин для машинного обучения, часть 1

Вместо предисловия Допустим, сидя вечерком в теплом кресле вам вдруг пришла в голову шальная мысль: «Хм, а почему бы мне вместо случайного подбора гиперпараметров модели не узнать, а почему оно всё работает?»Это скользкий путь — вы думаете, что достаточно пары ...