Хабрахабр

«Мышиная возня» в инфракрасном свете: внедрение наночастиц в субретинальную область глаза мыши

Не имеет значения где вы находитесь: в помещении или на улице, в городе или среди поля, в тропиках или в заснеженной тундре. Окружающий нас мир полон информации в самых разных формах ее проявления. Сам по себе этот орган, если утрировано, бесполезен в вопросе информирования вас об окружающей среде. Всегда и везде ваш мозг получает какую-то информацию. Однако далеко не всю информацию мы способны воспринимать, в частности инфракрасное излучение, которое не видимо нашим глазам. В помощь ему у нас есть органы чувств (глаза, уши, язык, нос и кожа). Сегодня мы с вами познакомимся с исследованием, в котором обыкновенную мышь наделили способностью видеть инфракрасное излучение ближней области посредством нанотехнологий. По крайней мере так было раньше. На эти и другие вопросы мы будем искать ответы в докладе исследовательской группы. Как ученые достигли этого, как чувствовала себя мышь после «усовершенствования» и какие перспективы сего открытия для человека? Поехали.

Основа исследования

Зрение у человека не самое лучшее, но и не самое худшее, среди жителей планеты Земля. Правильнее будет сказать, что оно имеет определенные ограничения. Мы способны воспринимать «видимый свет», то есть излучение в диапазоне от 400 до 700 нм. Но вот инфракрасное излучение ближней области (далее NIR) находится выше верхней границы в 700 нм.

В глазу имеются фоторецепторы — светочувствительные сенсорные нейроны сетчатки глаза. Если же копнуть чуть глубже, то проблема заключается в строении глаза млекопитающих, то есть и нас с вами. Внутри клеток имеются опсин* и родопсин*, которые играют одну из важнейших ролей в восприятии света, то есть в зрении.

Опсины* — рецепторы, связанные с G-белками, расположенные в фоточувствительных клетках сетчатки.

Родопсин* — белок, основной зрительный пигмент, содержащийся в палочках сетчатки глаза.

Весь этот коллектив рецепторов направлен на улавливание света, то есть фотонов. Но с NIR излучением все гораздо сложнее. В случае NIR фотоны обладают более низкой энергией. Следовательно, опсины должны обладать более низким энергетическим барьером, чтобы такие фотоны воспринять. В противном случае имеется только сильный тепловой шум. Другими словами фоторецепторы млекопитающих просто-напросто физически не способны «улавливать» световое излучение выше 700 нм, в частности NIR излучение.

Решить проблему с фоторецепторами можно предоставив им помощников в виде наночастиц, которые будут выполнять те функции, что недоступны естественным клеткам (органам, системам и т.д.). Но мы-то с вами знаем, что истинных ученых не могут остановить какие-то физиологические ограничения. Они разработали специальные наночастицы со встроенным автономным источником светового излучения, которые могут расширить диапазон зрительного спектра млекопитающего (в данном случае мышей). Это и сделали ученые в своем исследовании. Они преобразовывают инфракрасное излучение ближней области в более коротковолновое видимое излучение. Ученые поясняют, что наночастицы pbUCNP (retinal photoreceptorbinding upconversion nanoparticles) это своего рода преобразователи энергии.

Использование электроретинографии* и данных зрительных вызванных потенциалов* из зрительной коры мозга мыши помогло установить факт того, что сетчатка и зрительная кора были достаточно активны при воздействии внешнего раздражителя в виде инфракрасного излучения. «Модификация» глаз мыши производилась путем субретинальной инъекции (под сетчатку) наночастиц, разбавленных в натрий-фосфатном буфере. Проще говоря, мышь с внедренными наночастицами pbUCNP реагировала на NIR излучение.

Вызванный потенциал* — электрическая реакция органов на внешний раздражитель.

Электроретинография* — изучение состояния сетчатки глаза посредством регистрации биопотенциалов, возникающих при световом раздражении.

Также были проведены поведенческие тесты, которые также подтвердили вышеуказанное утверждение. Помимо этого ученые провели проверку биосовместимости наночастиц и организма мыши, которая показала лишь незначительные побочные эффекты. О результатах испытаний, тестов и анализа данных мы поговорим чуть позже, а пока нам стоит ознакомиться с тем, из чего же состоят эти удивительные наночастицы.

Структура pbUCNP

Основной задачей наночастиц являлась конвертация инфракрасного света (более 700 нм) в видимый. Учитывая, что глаз человека наиболее чувствителен к видимому свету с длиной волны в 550 нм, были созданы так называемые преобразовательные (или ап-конверсионные) наночастицы UCNP (1A и 1B).

с короткой длиной волны. Если говорить о фотонах, то ап-конверсия это процесс конвертации нескольких фотонов с более низкой энергией, то есть с большой длиной волны, в один фотон с более высокой энергией, т.е. А именно это и нужно, учитывая свойства фоторецепторов глаза млекопитающих.


Изображение №1

Эти наночастицы демонстрировали пик спектра возбуждения в 980 нм и пик излучения в 535 нм при световом воздействии в 980 нм (1C и 1D).

Использование ConA обосновывается тем, что данный белок отлично связывается с остатками сахара и производными внешнего сегмента фоторецептора, в результате чего образуются гликозидные связи*. Чтобы получить водорастворимые наночастицы, ученые применили белок конканавалин А (ConA) к поверхности частиц paaUCNP, то есть покрытых полиакриловой кислотой (1E).

Гликозидная связь* — ковалентная связь между молекулой сахара и другой молекулой.

Необходимо было проверить успешность внедрения ConA на поверхности UCNP. Для этого ученые добавили в раствор с pbUCNP b-циклодекстрин, который обладает такой же глюкозильной единицей, как и внешний сегмент фоторецептора. В результате этого произошла агрегация (объединение) ConAb-циклодекстрина (снимок ПЭМ на изображении 1G).

Следовательно, подобные наблюдения подтверждают, что pbUCNP смогут успешно присоединиться к поверхности фоторецепторов мыши.

Введение таких pbUCNP в субретинальную область глаза мыши (1F) привело к тому, что наночастицы связывались друг с другом, образуя тесную связь и с внутренними и c внешними участками колбочек и палочек (1J, 1K и 1L). На ПЭМ снимке 1H видно, что pbUCNP сохраняют свою монодисперсность при добавлении b-циклодекстрина, а все потому, что в данной комбинации отсутствует белок ConA. Таким образом формировался слой наночастиц с характерным ап-конверсионным спектром (снимок слева на 1I).

Если же в субретинальную область глаза мыши были введены paaUCNP частицы, то они образовывали очень непрочные связи, потому их можно было легко удалить с фоторецепторов (снимок справа на 1I).

Для проверки в субретинальную область глаза мыши также вводили простой раствор натрий-фосфатного буфера (без наночастиц) — разницы обнаружено не было. Проверка биосовместимости не показала каких-либо серьезных отклонений. Те побочные эффекты, которые были обнаружены, были связаны с самой субретинальной инъекцией и полностью исчезли в течение 2 недель после процедуры.

То есть, структура слоев сетчатки не деградирует (это видно на изображениях и ). Проверка целостности сетчатки и здорового количества фоторецепторов показала, что даже при введении 50 мг pbUCNP в каждый глаз отрицательных изменений не наблюдается.


Изображение №2

Анализ показал незначительное воспаление сетчатки на 1-ой, 2-ой, 4-ой и 10-ой неделе после инъекции pbUCNP ( и ). Также ученые решили проверить наличие воспалительных процессов в сетчатке глаза крысы, использовав маркер микроглии Iba1.

Сигналы TUNEL были обнаружены только спустя 3 дня после инъекции как pbUCNP, так и чистого натрий-фосфатного буфера (2D). Помимо этого был проверен апоптоз (распад) клеток сетчатки после инъекции посредством маркировки терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы (TUNEL). На 1-ой, 2-ой, 4-ой и 10-ой неделе после инъекции признаки TUNEL не были обнаружены ().

Суммируя результаты вышеописанных анализов, ученые пришли к очевидному выводу — pbUCNP не несет вреда организму испытуемого (мыши), кроме определенных побочных эффектов, вызванных исключительно самой процедурой укола в субретинальную область глаза.

Теперь, когда мы знаем что такое pbUCNP и как он влияет на здоровье подопытных мышей, можно перейти к рассмотрению результатов практических испытаний работоспособности наночастиц pbUCNP.

Результаты исследования


Изображение №3

Для проверки реакции фоторецепторов на инфракрасное излучение были взяты образцы палочек из сетчатки глаз у мыши с инъекцией наночастиц и у мыши без нее ().

Палочки мышей, которым была сделана инъекция pbUCNP, показали нормальный фототок, вызванный видимым светом в 535 нм, в отличие от мышей без инъекции (без инъекции — и с инъекцией — 3D).

Также стоит отметить сильное сходство амплитуды и кинетики фототока в палочках мышей с pbUCNP при воздействии света 535 нм и 980 нм (3F, 3G и 3H). При воздействии световой вспышки в 980 нм была получена ответная реакция только от палочек мышей с pbUCNP (), палочки обычных мышей никак не отреагировали (). Также было выявлено, что палочки (после инъекции) быстро адаптируются к инфракрасному свету, как это обычно происходит с видимым светом. А соотношение времени и пиков говорит о том, что задержки активации палочек при воздействии инфракрасного излучения не было.

При этом результаты ERG мышей с pbUCNP сильно напоминали результаты при воздействии светового излучения видимого диапазона (535 нм). Электроретинограмма (ERG) мышей с и без инъекции также подтвердила факт реакции на инфракрасное излучение в 980 нм. У контрольной группы мышей (без наночастиц) реакций не было.

Эта проверка показала активацию колбочек излучением в 980 нм посредством воздействия на них наночастиц pbUCNP. Кроме этого ученые провели тест с мышами, у которых не было палочек.

То есть, они решили воочию понаблюдать за поведением мышей с и без инъекции в специальных условия. После проведения лабораторных тестов ученые перешли к проверке на практике, так сказать.


Изображение №4

Второй вариант эксперимента основан на взаимосвязи светового раздражителя и вызванного им чувства страха (4E и 4F). Для практического эксперимента использовались две коробки: темная и освещенная посредством излучения в видимом и инфракрасном диапазоне ( и 4D). А теперь детальнее о каждом из экспериментов.

Видимый свет был заменен на светодиодный с длиной волны 980 нм. В первом тесте с темной и освещенной видимым светом коробкой мыши, естественно, предпочитали находиться в темной. А вот контрольная группы мышей (без инъекции) не видела никакой разницы между двумя коробками (темной и со светом 980 нм), так как они буквально не воспринимали инфракрасное излучение. В таком варианте мыши с инъекцией наночастиц продолжали выбирать темную коробку, а не освещенную, следуя своим врожденным инстинктам, так сказать.

На этапе подготовки мыши из обеих групп обучались тому, что вслед за 20-секундным излучением светом 535 нм (видимым) последует двухсекундный незначительный удар током (). Второй эксперимент был связан с изучением еще более обдуманных действий мышей. В ответ на такой раздражитель должна последовать вполне естественная ответная реакция у мышей — оцепенение*.

В случае если хищник уже напал на них, они могут «притвориться мертвыми» (оцепенеть), тем самым сбить атакующего с толку и, уловив подходящий момент, сбежать. Реакция оцепенения* — у некоторых видов животных, которые как правило являются добычей, существует защитный механизм (так сказать, последний шанс).

Как мыши реагируют в случае опасности (оцепенеть, спрятаться или агрессивно тряски хвостом).

Во время этапа фактического тестирования применялось световое излучение как в 535 нм, так и 980 нм. В результате мыши с инъекцией pbUCNP проявляли реакцию оцепенения при обоих типах светового воздействия, так как ожидали удара током. А вот мыши без наночастиц никак не реагировали на инфракрасное излучение. А это говорит о том, что они не воспринимали его во время подготовки и, следовательно, не смогли связать невидимое для них излучение с ударом тока. У контрольной группы мышей была ответная реакция только на свет в видимом диапазоне. На изображении 4F показано сравнение результатов данного теста у контрольной группы мышей и у мышей с инъекцией.

Дабы получить ответ на этот вопрос ученые провели еще один тест — измерение VEP, т.е. Данные практические тесты подтвердили факт того, что мыши с pbUCNP воспринимают инфракрасное излучение, но могут ли они реально видеть в таком диапазоне, в прямом смысле этого слова? Для этого в шести областях зрительной коры мозга мыши были установлены электроды (№ 1, 2, 3 и 5 — в монокулярных областях и №6 — бинокулярных областях). зрительных вызванных потенциалов ().


Изображение №5

А вот при свете в 980 нм мыши разделились на две группы, как и в предыдущих тестах. Когда на глаза воздействовал видимый свет (535 нм), наблюдалась реакция во всех областях зрительной коры у всех мышей (с и без наночастиц), что вполне ожидаемо (5B и 5D). У контрольной группы никаких VEP выявлено не было. У мышей с инъекцией были обнаружены VEP в бинокулярных областях зрительной коры мозга (5C и 5E). Стоит отметить, что проявление VEP именно в бинокулярных областях согласуется с местом проведения инъекции (височная сторона).

Следующей проверкой опять стал более практический тест с водным лабиринтом в форме буквы «Y» (), по которому мыши с pbUCNP должны были ориентироваться по инфракрасному излучению. На этом «мышиная возня» не закончилась.


Изображение №6

Всего учеными было сделано 5 вариантов теста с разными визуальными стимулами и световым излучением. Во время подготовки мышей обучали находить спрятанную платформу, которая была связана с одним из двух маршрутов по лабиринту.

Мыши с наночастицами успешно обучились различать ориентации полос (вертикальную или горизонтальную) и отлично их видели при воздействии светового излучения в 980 нм. В первом варианте были световые решетки (), положение полос на которых указывал направление движения. В тесте где использовался видимый свет (как и во время обучения) обе группы мышей успешно справились с задачей. Контрольная группы выбирала платформы в случайном порядке, то есть не могла отличить их друг от друга ввиду невозможности видеть в инфракрасном спектре ().

31 ± 0. Измерение волнового числа (пространственной частоты) показало, что у мышей с инъекцией этот равен 0. У мышей из контрольной группы этот показатель равен 0. 04 при видимом свете. 02, то есть особых отличий между обеими группами испытуемых нет. 35 ± 0. В случае инфракрасного излучения у мышей с pbUCNP вышеуказанный показатель был 0. Следовательно, введение наночастиц в сетчатку не повлияло на то, как мыши воспринимают видимый свет. 06. 14 ± 0. Такое снижение пространственной частоты ученные связывают с изотропным излучением и рассеянием видимого света от возбужденных инфракрасным светом наночастиц (6D).

Было сделано 2 пластины со светодиодными матрицами видимого (535 нм) и инфракрасного (980 нм) излучения, которые расположены перпендикулярно друг к другу. Во втором варианте теста ученые решили проверить мешает ли восприятию инфракрасного излучения фотонов излучение в видимом диапазоне. Когда все светодиоды были выключены, обе пластины выглядели идентично на фоне видимого света ().

Во время фактического теста только мыши с инъекцией смогли успешно распознать пластины (6F). Во время подготовки в тестовой камере было включено освещение (видимый свет, 196 лк) и только 980 нм светодиоды. В случае, когда были включены только 535 нм светодиоды, обе группы мышей показали хорошие результаты, как и ожидалось. Это говорит о том, что их восприятие инфракрасного излучения никак не ухудшилось из-за фонового излучения видимого света.

Мыши с pbUCNP успешно различали фигуры в видимом и инфракрасном свете, когда тестовая камера была неосвещенной, то есть в темноте (6H). Следующий тест заключался в распознавании треугольников и кругов (6G). Контрольная группа могла обнаружить только фигуры из видимого света.

Мыши с pbUCNP все так же успешно отличали фигуры инфракрасного/видимого света при фоновом инфракрасном излучении. После этого в задачу была добавлена еще одна переменная — фоновый свет, но не видимый, как раньше, а инфракрасный.

В данном тесте был водный лабиринт с платформами, на которых изображался одновременно круг и треугольник. В заключительном тесте ученые решили выяснить, могут ли мыши с инъекцией видеть фигуры в инфракрасном и видимом диапазоне одновременно. А вот во время тестирования были и треугольники и круги (980 нм) в случайной последовательности (6I). Во время подготовки активными были только треугольники в видимом свете. Проверка результатов данного теста у обеих групп испытуемых мышей подтвердила, что мыши с инъекцией делали выбор той или иной платформы не случайно, в отличие от контрольной группы. Как и ожидалось, мыши с pbUCNP прекрасно отличали фигуры (6J). Таким образом, можно слетать вывод, что инъекция pbUCNP позволяет мышам видеть объекты как в инфракрасном, так и в видимом диапазоне одновременно.

Для более детального ознакомления с нюансами исследования настоятельно рекомендую заглянуть в доклад ученых и дополнительные материалы к нему.

Эпилог

Подобное исследование является отличным доказательством того, что нанотехнологии могут быть применены в очень разных направлениях. Конечно, говорить о том, что их возможности безграничны пока еще очень рано, но с каждым днем мы получаем все больше и больше новым путей применения нанотехнологий. В данном конкретном случае использование наночастиц для того, чтобы одарить мышей инфракрасным зрением является не только занятным экспериментом, но и подтверждением уникальных возможностей внедренных улучшений в биологические системы. Сами ученые пока не готовы делать громких заявлений касательно применения их разработки в медицине или в каких-либо других областях, однако они будут продолжать свои исследования с целью усовершенствовать вышеописанные наночастицы и, возможно, наделить их новыми свойствами.

Можно ли разрешать человеку изменять свое тело? Как бы то ни было, широкое применение аугментаций человеком для совершенствования и изменения своего тела произойдет еще нескоро ввиду не только несовершенства технологий, но и множества этических вопросов, которыми уже задаются многие общественные деятели. Как это повлияет на социально-классовое расслоение в обществе? Где граница допустимых аугментаций? Список подобных вопросов можно продолжать, но четких ответов на них пока никто не дал (игры серии Deus Ex не в счет). Породит ли это новые конфликты в и без того конфликтом мире? Возможно принцип «время покажет» подходит сюда как нельзя лучше.

И, конечно же, пятничный оффтоп:

Креативная реклама с неожиданным сюжетным поворотом 🙂

Благодарю за внимание, оставайтесь любопытствующими и отличных всем выходных, ребята.

Вам нравятся наши статьи? Спасибо, что остаётесь с нами. Поддержите нас оформив заказ или порекомендовав знакомым, 30% скидка для пользователей Хабра на уникальный аналог entry-level серверов, который был придуман нами для Вас: Вся правда о VPS (KVM) E5-2650 v4 (6 Cores) 10GB DDR4 240GB SSD 1Gbps от $20 или как правильно делить сервер? Хотите видеть больше интересных материалов? (доступны варианты с RAID1 и RAID10, до 24 ядер и до 40GB DDR4).

VPS (KVM) E5-2650 v4 (6 Cores) 10GB DDR4 240GB SSD 1Gbps до лета бесплатно при оплате на срок от полугода, заказать можно тут.

класса c применением серверов Dell R730xd Е5-2650 v4 стоимостью 9000 евро за копейки? Dell R730xd в 2 раза дешевле? Только у нас 2 х Intel Dodeca-Core Xeon E5-2650v4 128GB DDR4 6x480GB SSD 1Gbps 100 ТВ от $249 в Нидерландах и США! Читайте о том Как построить инфраструктуру корп.

Теги
Показать больше

Похожие статьи

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

Кнопка «Наверх»
Закрыть